小室操作处理的步骤

Step1.选择水凝胶类型包被小室：

水凝胶主要分为两种：动物来源（如基质胶、胶原蛋白胶、纤维蛋白胶）或是合成型水凝胶（如Vitrogel 3D^TM）。以24孔板的小室为例，取70-100μl（体积量不需太多，刚好将聚碳酸酯膜浸湿即可）稀释好的水凝胶，均匀涂抹在小室内的膜进行包被，37℃放置1-3 h左右(时间取决于选用的水凝胶类型)。

                                               ▲细胞迁移和侵袭实验图示

Step2.制备细胞悬液:

将进行实验的细胞消化下来，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2次，用不含血清培养基将细胞重悬，并进行细胞计数，调整细胞密度至5×10⁴/ml -5×10⁵/ml (根据实验决定细胞接种数量)。

Step3.接种细胞：

取100µl细胞悬液加入24孔板上层小室，24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，避免下层培养液和小室间气泡产生，气泡会减弱下层培养液的趋化作用，如果不小心出现气泡，需要将小室提起，将气泡除去，再将小室放进培养板。

Step4.培养时间：
培养时间由实验目的决定，如细胞共培养、细胞趋化、细胞迁移以及细胞侵袭等多种方面的研究；细胞迁移与侵袭的能力，除了培养时间需要考虑外，也需考虑细胞的处理！

Step5.结果分析：

结束培养，取出小室，移除孔中培养液，用无钙镁的PBS洗2-3次，使用甲醇固定15-30分钟后，将小室适当风干。用预备好的0.1%-0.5%结晶紫染色，再用棉签轻轻擦掉内层未迁移细胞，用PBS洗3次。在200倍或400倍显微镜视野下，随机选择五个视野拍照观察并计数穿过膜后的细胞。

▲统计穿膜后细胞数量图示

Reference

Transwell® Invasion Assays. Methods Mol Biol. 2011; 769:97-110