细胞消化知多少？Darling我们分手吧！

每个做细胞实验的人，不管去哪“浪”，

心里都会有个牵挂：

我的细胞
过两天要传代！
 

　　大部分组织细胞离体培养时，会以贴壁的形式生长（除了取自血、脾或骨髓的细胞）;完全培养基中的血清，含有许多带阳性电荷的促细胞附着因子（层黏连蛋白 Laminine、纤维链接蛋白 Fibronectin 等胞外基质），能帮助细胞附着于带阴性电荷的底物上（玻璃或塑料培养容器），并形成键结、贴壁伸展。
 

 

▲ 阳性电荷的促细胞附着因子，能帮助细胞附着于带阴性电荷的底物上

 

　　所以当细胞长满需要分盘的时后，就要想办法让细胞和培养底物说 再见！也就是所谓的～
 

细胞消化

Cell Detachment
 

常见细胞消化法有以下三种：
物理机械法	离子螯合法	酶消化法

 

 

❂ 　物理机械法

　直接用液体吹打或用刮刀，施予外力让细胞与培养底物分离；适用于贴壁性弱的细胞传代，但相较于其它消化方法，这种外力无法量化控制，细胞分散效果差，且可能会造成大量细胞破损，使内容物释放到培养基，进而影响细胞传代状态。

 

▲细胞刮勺

 ❂ 　离子螯合法
 

　　细胞膜表面蛋白大多需要钙、镁离子来维持与胞外基质的稳定键结，当然也包含各种黏附蛋白（例：整合素、钙黏着蛋白、桥粒等），螯合剂会在不破坏细胞膜表面蛋白的状况下，抽离这些离子，使黏附蛋白失活而减少细胞-细胞间及细胞-底物间的连接作用，让细胞较容易在施予外力时，脱离培养底物并促进细胞分散。
 

0.02% EDTA是细胞传代最常用的离子螯合剂，在37℃作用效果最佳（消化较敏感的细胞可在4℃作用），适用于消化一般贴壁性细胞或细胞表面标记实验细胞。
但EDTA无法用血清终止其反应，所以在消化细胞后必须用缓冲盐溶液（如：PBS）清洗离心，以免影响后续细胞贴盘效果。

▲ EDTA（黑）能螯合二价离子（红）
 

❂ 　酶消化法
 

　　用蛋白水解酶消化连接细胞及培养底物的蛋白质，适用于消化贴壁性稍强的细胞。
 

目前常用蛋白水解酶主要有两种：

• 胰蛋白酶（Trypsin）

　
　为一种来自于胰腺的丝氨酸蛋白酶；能辨识并剪切胜肽链中的赖氨酸（Lys）和精氨酸（‎Arg）羧基端（两者之一紧跟脯氨酸状况除外），所以能直接作用在细胞外的黏附蛋白及胞外基质上，但如果作用时间过长，细胞膜上內嵌的其他蛋白也会被水解，导致细胞膜受损；不同细胞适合的胰蛋白酶使用浓度及作用时间都各有不同。

　
使用胰蛋白酶消化前，请先用不含钙、镁离子的平衡盐溶液清洗细胞，因为血清中的抗凝血酶III及平衡盐溶液中的钙、镁离子，都会降低胰蛋白酶活性，导致消化效果不佳；消化完毕后，可直接用含血清的培养基或其他胰蛋白酶抑制剂终止消化反应。
 

• 胶原酶（Collagenase）

　为一种胶原水解酶，大多由细菌提取而来；能辨识并剪切Pro-X-Gly-Pro胜肽序列，而此序列在胞外基质主成分-胶原蛋白中出现的频率比一般蛋白高很多，使得胶原酶能较专一的作用在胞外基质上，所以对细胞的伤害比胰蛋白酶小，且在钙、镁离子环境中仍有活性，可用PBS和含血清的培养液配制，操作简便，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。
 

细胞还是不愿意跟底物说再见！咋办？

面对贴壁性极强的细胞，可进一步使用 含EDTA的胰蛋白酶 来消化细胞，EDTA会抓住细胞表面未洗净的钙、镁离子，降低黏附蛋白活性使细胞不会彼此粘黏，同时让胰蛋白酶在不受钙、镁离子干扰下发挥最大作用剪切胞外基质及黏附蛋白，让细胞顺利脱离培养底物且减少细胞成团现象。
 

细胞消化小技巧

不一定要一次把所有细胞都要消化下来！

      晃动培养盘并在显微镜下用肉眼观察，只要70~80%细胞都收缩了或超过适合消化时间，就该终止消化反应，如果细胞量够即可进行后续传代或实验步骤；如果细胞量不够，则可视情况用不含钙、镁离子的平衡盐溶液清洗仍贴壁的细胞，再进行一次消化反应。
 

▲ 消化不下来的细胞（黄）请视情况决定是否再消化一次。
 

 

不一定要吹打成完全单细胞悬液！

　　一般细胞脱离培养底物、并经过5~10次轻柔吹打后，会在细胞悬液里形成小规模聚集(约5~10颗细胞)，所以不需要过度延长消化时间想让细胞完全分离成单细胞悬液。
 

消化效果不佳，先提升消化液浓度、再加长作用时间！

　当你选定了一种消化方式 (物理机械法除外)，发现效果不佳，首先应考虑提高EDTA或胰酶浓度，效果再不佳才加长消化的作用时间，避免细胞长时间浸泡在消化液中造成的细胞膜损伤。

 （一般消化液使用：0.02%~0.04% EDTA作用5-20分钟；0.2~0.5% 胰蛋白酶作用1~5分钟）

 

结语
 

 细胞消化 ，是一个看似很简单，但是有很多技术含量的步骤。消化好坏、是否污染、有无受伤，都在这短短的五六分钟里决定。


当我们已经可以顺利操作细胞培养实验，接下来要思考的，就是如何让细胞长得更健康、更均一、做出来的实验才会更完美。


祝各位的细胞都颗颗透亮、粒粒分明、活力旺盛！
 

 

BI细胞培养小课堂

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