本期我们想说说悬浮细胞
比起贴壁细胞，悬浮细胞不需要消化
养起来更方便、省心
但也没那么简单
总是会遇到一点问题：
为什么总是出现死细胞，
说好了传代很easy的，
冷冻、复苏又出现问题了！

关于悬浮细胞，你知道多少？

• 悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态。

• 悬浮培养的细胞一般为淋巴细胞或血液系统来源的细胞（如人胃癌细胞SNU-5，小鼠白血病细胞WEHI-3, 人白血病细胞K-562, HL-60），这种细胞体积小，它们天生就生活在悬液（血液）中。由于缺乏黏附分子的表达，在培养基中呈现悬浮状态，细胞大体呈球形或椭球型。

图为K-562细胞，来源于ATCC

关于悬浮 de 传代

1. 悬浮细胞无需通过酶的作用使其从培养容器表面脱离，整个过程较为迅速，对细胞的损伤也较小。通常有两种方法：

• 直接给带传代的培养瓶中补充一定量的新鲜培养基，然后分装。

• 先通过离心弃掉营养匮乏的旧培养基，再用适量的新鲜培养基重悬细胞沉淀。

2. 至于何时传代，最准确的是根据细胞密度来确定。传代最大细胞密度随细胞系不同而有所差异，ATCC细胞库里提供的细胞培养信息，里面有培养条件选项，会详细说明细胞的接种密度和培养密度，有的还有图片或参考产品使用手册。

如何有效去除死细胞？

细胞复苏或培养过程中常会出现死细胞和细胞碎片，可通过低速离心的方法去除死细胞或细胞碎片，死亡细胞的碎片会留在上清中，即可除去。不同细胞离心力可能不一样，可以先试一下300×g~500×g这个离心力，如果能离下大部分细胞就行，如果一点细胞都离不下来就适当加大离心力和时间。

悬浮细胞的冻存和复苏与贴壁细胞基本一致：

1. 冻存
我们推荐使用BI的无血清冻存液，直接按以下步骤进行，操作更加方便，平均活细胞回收比例超过90%：

• 以200×g-300×g离心3分钟，弃去上清，收集细胞。

• 用BI无血清冻存液将细胞重悬（不需回温），将细胞密度调整为3~5x10⁶ cells/ml，添加到冻存管中（一般每管1ml）。

• 建议将含有细胞悬液的冻存管放入程序降温盒或是保温杯中，置于-80°C冰箱6小时以上或是过夜（或不需要程序降温)。

• 将冻存管迅速移到液态氮气相中保存。

• 冻存24小时后，建议检测细胞存活率。

2. 细胞的复苏，BI建议按以下方法操作：

• 将细胞冻存管由液态氮气相中取出，置于室温回温，不用水浴溶解。此时可准备新鲜培养基、无菌15ml离心管、培养瓶。

• 在生物安全柜内，直接以少量培养基反复冲融，使细胞团块化冻。

• 先在无菌15ml离心管中加入5ml培养基，再将化冻的细胞悬液加入离心管中。以200×g~300×g，3分钟离心收集细胞。

• 倒去上清液，重悬细胞，移到培养瓶中培养。

• 建议使用20%FBS复苏细胞，等细胞长满后，再降回原来血清比例。

 

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