提到多能干细胞（PSC）培养，

经常会遇到诸如此类不省心的事儿

。。。。

那么关于PSC传代培养、冻存、复苏

及基质使用

都有什么技巧和要点？

这次我们继续就广大用户遇到的困难，

用心总结

快把你们的眼神转过来！

自由选择板凳，沙发，还是躺床上涨姿势

此外若仍有疑问，欢迎大家积极发言！！！

（可在文章下方留言或私信）

     无血清培养基    

PSC培养通常推荐使用无血清培养基，

比如，BI NutriStem® hPSC无血清培养基。

支持hESC及iPSC快速贴壁并大量增殖，bFGF和TGFβ因子浓度更低，不干扰细胞代谢，不刺激细胞分化。

并且适用于临床，已获得美国FDA二类原料药证号，DMF NO：30984 

    hPSC传代     

何时开始传代培养？

1. 滋养层细胞老化
2. 细胞集落太密或细胞停滞增长
3. 细胞集落已经有合并的现象
4. 细胞集落开始堆积或分化

 

完全培养基的准备

1. 冻存的 NutriStem^®  hPSC XF在室温或2-8℃解冻，避免反复冻融，解冻的培养基可以存储2-8°C，2周内使用完毕。
2. 如果需要较小的数量，以无菌技术配制成等份，避免反复冻融。
3. NutriStem^® hPSC XF使用前必须回温至15°C-30°C，为确保培养基的稳定性，只需回温所需的量，贮藏时避免照光。

如何做好传代培养？

1. 以6孔板滋养层培养为例，吸除孔板内的培养基，每孔加入1.0 ml胶原酶溶液。
2. 放置在37°C或室温，直到细胞集落从孔板的边缘开始松动（孵育的时间，在细胞株和细胞聚落大小之间会有所不同）。一般孵育3分钟后开始检查细胞集落，勿孵育时间过长，hPSC细胞对胶原酶比较敏感，容易从孔板脱落。
3. 吸去分离液，用2ml无菌培养基DMEM/F-12 (1:1)轻洗两次。
4. 加入1ml培养基，用5ml移液管轻轻将脱落hPSC细胞从孔板内吹打下来，谨慎吸出上清至离心管，不要吸到滋养层细胞。
5. 在室温以800rpm离心3~5min。
6. 吸除上清，加入NutriStem^®  hPSC XF培养基，用5ml移液管轻轻将细胞团打散，将细胞接种至有滋养层细胞孔板中，加入2.5~3.0ml NutriStem^® hPSC XF培养基，放入37℃，5% CO₂培养箱内培养。

7.每天更换一次2.5~3.0ml新的NutriStem^® hPSC XF培养基
 

关于细胞传代比例

保持细胞的传代比率很重要，

生长较慢的细胞按1：4传代，生长较快的按1：8传代

 

 

    基质的使用   

无滋养层细胞培养，建议使用层粘连蛋白LN521。

在LN521上，hPSCs细胞以单细胞形式接种，生长成为均质的单细胞层，无自然分化，也无须使用凋亡抑制剂。

细胞约在4至6天内达到融合，并扩增10至25倍

周末也无须进行换液

 

层粘连蛋白包被

层粘连蛋白涂层包被，包被浓度0.5-1μg/cm²

（一般包被 0.5μg/cm²），以下以6孔板为例：

1. 在2-8°C缓缓解冻层粘连蛋白（重组LN521）。
2. 用含钙镁的DPBS稀释LN521至5ug/ml

3. 每孔加入2ml稀释好的LN521。
4. 密封培养器皿（如使用parafilm^® 膜）防止蒸发，在2-8°C孵育过夜，确保层粘连蛋白溶液均匀分布在表面。避免表面干燥，以免层粘连蛋白失活。

 

在LN521上培养hPSC细胞

1. 以6孔板滋养层培养为例，每孔加入适量DPBS （2ml/well 不含钙离子和镁离子)轻轻冲洗1次，每孔加入1.0ml重组胰酶-EDTA，覆盖整个细胞表面，在37°C 作用 2~4min(勿在EDTA孵育时间过长)。

2. 加入4.0ml的1xSBTI ，中和重组胰酶-EDTA，并将细胞吹打下来。谨慎收集细胞悬液到离心管中, 200xg离心5min。

3. 离心后，弃上清液，用1.0ml完全培养基悬浮后，混匀细胞悬液。台盼蓝1:1混匀，计数细胞。

4. 将细胞接种至层粘连蛋白包被培养器皿中，加入3.0-4.0 ml培养基，10-20,000 /cm²细胞密度，培养约4-5天。

5. 在37℃，5%CO₂培养箱内培养，48小时内不要移动孔板(会促进分裂后细胞分化）。每天更换一次新的NutriStem^® hPSC XF培养基，2.5~3.0ml。48小时后达到最佳培养密度，4-6天后，大多数细胞达到倍增10-25倍。

关于细胞冻存和复苏，

我们已经总结过，

BI教您如何做好细胞冻存与复苏？

看过的童鞋可以再复习一遍，

看看是否真正掌握！
 

细胞冻存

若是贴壁细胞，请先将细胞消化下来；若是悬浮细胞，请直接按以下步骤进行：

1. 以200-300g离心3分钟，弃去上清，收集细胞。

2. 用BI无血清冻存液将细胞重悬（不需回温），将细胞密度调整为3~5x10⁶

cells/ml，添加到冻存管中（一般每管1ml）。

3. 建议将含有细胞悬液的冻存管放进程序降温盒或是保温杯中，置于-80°C冰箱6小时以上或是过夜（或不需要程序降温)。

4. 将冻存管迅速移到液罐氮中保存。

5. 冻存24小时后，建议检测细胞存活率。

 

细胞复苏

1. 将细胞冻存管由液罐氮中取出，置于室温回温，不用水浴溶解。此时可准备新鲜培养   基、无菌15ml离心管、培养瓶等。

2. 在生物安全柜内，直接以少量培养基反复冲融，使细胞团块化冻。

3. 先在15ml无菌离心管中加入5ml培养基，再将化冻的细胞悬液加入离心管中。以200~300g，3分钟离心收集细胞。

4. 倒去上清液，重悬细胞，移到培养瓶中培养。

 

关注微信公众号
可留言或私信我们

BI中国市场部：上海逍鹏生物科技有限公司
产品咨询：021-58785545-8006, 18917190011
技术支持：400-820-3979

了解详细信息可戳原文

详情点击：阅读原文