上次的鱼骨图分析大家还没有看过瘾吧

这不，小编又双叒叕来啦！

说完外源污染，那么接下来我们再从细胞层面讨论讨论

———内源异常

内源异常同样也可以分为以下几点

 人为选择/突变

 老化

 细胞冻存/复苏

 融合度过高才传代（>90%）

 传代密度过低

接下来，我们将逐条为您剖析噢~

人为选择/突变

在体外培养细胞的过程中，细胞会因操作过程而产生人为筛选：

1. 胰酶消化是最常被忽略的人为选择过程，易被消化的细胞容易被传代；
2. 细胞过度的分化或刺激时及可能造成细胞异常的突变，例如 HeLa cell 虽然还保有人的基因序列，但染色体数目曾被观察到有异常突变增加（原 HeLa 为 46 条，目前有研究人员观察到 70-90 条染色体的案例）；
3. 文献报导指出，hES 细胞株已被证实原位癌基因(TP53) 变异概率，随着培养代数增加更易有突变产生 (Nature 2017)。

解决方案：

建立并记录好细胞档案（形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、有无支原体和潜存病毒等），为保障实验材料的一致性，应将长期使用的细胞株建立细胞种子库（Seed Stock）与工作库（Working Stock）；细胞株建库资料要详细记载，并定期每 3-6 个月安排身份鉴定 （STR）。

美国细胞库（ATCC）建议细胞株入库的基本要求：

（1）培养简历 ：组织来源日期、物种、组织来源、供体正常或异常健康状态、性别、年龄、细胞已传代数等；
（2）冻存液 、培养基和保护剂名称；
（3）细胞活力 ，冻融前后细胞接种存活率和生长特性(细胞倍增时间，生长繁殖曲线，分裂指数等)；
（4）培养基种类和名称、血清种类及浓度；
（5）细胞形态类型，如内皮、上皮或成纤维细胞等；
（6）核型二倍体或多倍体，标记染色体有或无；
（7）无污染情况包括细胞、真菌、支原体、原虫和病毒等；
（8）物种检测，以证明细胞有无交叉污染；
（9）免疫检测一两种血清学检测；
（10）细胞建立者姓名、检测者姓名.

老化

无论是原代细胞或是细胞株，在细胞培养过程中细胞老化现象是存在且常见的，但却容易被操作人员忽略，老化的细胞会出现特征包括：细胞增殖变慢、细胞核体积异常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、细胞体积增大、细胞扁平、细胞质中出现空泡等现象。
老化细胞不会立即死亡，但其基因表达会发生变化，如果细胞老化现象严重，建议从种子库或工作库重新复苏细胞。

解决方案：

Dr. Cell 可提供：细胞老化检测（Cell Senescence Detection）
细胞老化检测可准确地判断出老化细胞的百分比，以决定是否要使用代数更低的细胞，维持实验材料的一致性。细胞培养过程，防止衰老不二法门：还是要做到勤观察、勤换液、勤传代、勤保种。一旦细胞衰老后，细胞很难再重新年轻化，此时，只能重新复苏细胞。

   

图 1.衰老细胞                           图 2.正常细胞
 

细胞冻存/复苏

慢冻快融

冻存细胞过程，建议程序降温速度为 1℃/min。细胞冻存时，细胞内外的水分会很快形成冰晶，冰晶的形成后会造成细胞损伤或细胞的死亡。为了保护细胞，冻存时会添加保护剂在冻存液中，目前多采用 DMSO 或甘油，使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性。

复苏细胞过程，让细胞冻管在 37℃ 环境快速解冻，待其全部快速融化，避免冰晶对细胞造成伤害；解冻后的细胞可直接接种到含完全培养基的细胞培养瓶中进行培养，24 小时后再更换新鲜完全培养液，以去除旧培养液中的 DMSO; 如果担心 DMSO 造成细胞毒性，可以待细胞解冻后将细胞缓慢加至含培养基离心管中离心，以稀释 DMSO 的浓度。复苏的细胞，约需数日或传一至二代，其表现才会恢复稳定。

解决方案：

掌握“慢冻快融”的原则，进行程序降温

慢冻→两种办法：

1.手动程序降温，将细胞依序放在 4℃（30分钟）、-20℃（1小时）、-80℃（过夜）后移至液氮中保存。

2.程序降温盒，一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器，使细胞以每分钟约 -1℃ 的速度降至 -80℃（过夜），然后移至液氮中保存。

快融：将冻存在液氮中的细胞冻存管快速移至已 37℃ 预热的水浴锅中（水面需低于管口，避免水分意外进入冻存管造成潜在污染），使细胞冷冻悬液迅速融化；此做法能让细胞冷冻悬液快速通过 -20℃~0℃ 这个结晶形成温度范围，避免冰晶进入细胞形成再结晶，对细胞造成二次伤害。

Biological Industries（BI）可提供：

中文名称	货号
无血清细胞冻存液	05-065-1
无血清间充质干细胞冻存液	05-712-1
无血清干细胞冻存液	05-710-1
D10 无血清冻存液	05-713-1

 

融合度过高才传代（>90%）

一旦细胞养太久至融合度过高（>90%）才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。（如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象）。

图 3

 

解决方案：

尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到 80% 即可传代分盘。
细胞融合度：在细胞培养中指的是细胞在培养表面（培养皿/瓶）所占的比例。

传代密度过低

哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到 80-90% 密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。

图 4

 

解决方案：

细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度。

如何确定细胞的正确初始接种密度? 美国细胞库（ATCC）建议各类不同细胞株接种密度：

 

细胞类型	接种密度
常见肿瘤细胞株	2-4 x 106 viable cells/25cm2
成纤维细胞株	2-4 x 106 viable cells/25cm2
淋巴细胞/悬浮细胞	3-4 x 105 viable cells/ml
杂交瘤	2 x 105 viable cells/ml
成肌细胞	1-2 x 104 viable cells/cm2

 

END

好啦，本期介绍到这里也就啦

后续小编会根据顺序

继续为大家分享噢~

那么即将开学的您有准备好收心吗

 

小编温馨提示：

Reference

“Human pluripotent stem cells recurrently acquire and expand dominant negative P53 mutations”-Florian T. Merkle et al.,Nature volume 545, pages 229-233（11 May 2017）

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