做实验的时候为什么要进行细胞冻存呢？

细胞冻存有哪些好处呢？

1.  节省实验室空间、时间、经费

2.  若实验失败，还有重来的机会

3.  确保重复实验的一致性

4.  确保未来实验的连贯性

但是，经常会有用户反映，细胞冻存与复苏遇到了问题，看似简单的一步其实并不简单。

那么如何做好细胞冻存呢？今天跟随我们一起来了解一下细胞冻存时需要注意的事项和技巧吧。

细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使细胞代谢活动近乎停止。细胞因此进入休眠状态，使细胞“不会老”，所以可以长期保存。

因为冻融过程对所有细胞和组织都是有一定伤害的，因此，需要开发出有效的技术来防止细胞死亡和损伤。

▲ 细胞冻存过程

 

低温保护剂可保护细胞不受细胞内冰冻影响，目前多采用DMSO，甘油，乙二醇和丙二醇等渗透型低温保护剂。它们的作用机制包括：自由进入细胞，取代水，使冰点下降，充当盐的二次溶剂，提高细胞膜对水的通透性。如下图所示：

▲ 使用和不使用冻存液对比图

 

但是，部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞，却也会引起细胞毒性，尤其是在室温下。因此，在标准的自制冻存液中，会含有血清，因为血清可以降低细胞毒性。

但，血清并不是完美的成分：

血清的优势	血清的缺点
有助于保护细胞	含有生长因子，激素等未知成分
	不推荐用于细胞库，临床应用
	增加污染几率
	成本波动

▲ 血清优缺点比较

那么有无动物源成分替换物吗？

甲基纤维素也被认为是细胞冷冻保存的保护剂，所以可作为胎牛血清的替代物。

优势：

• 化学成分明确

• 有保护性

▲ 甲基纤维素结构图

尽管大多数研究和医学领域都存在优化的冷冻保存方案和已发表的配方，但技术问题依然存在。

 

 

冻存液的选择

首先我们需要明确首要任务是什么？我们的细胞需要什么？

回收率？

成活率？

冻存液成分？

无血清或无外源性要求？

我需要使用哪个方法？

商业培养基相比于自制培养基的优势？

Biological Industries推出了一种即用型，无动物源成分的冻存液：

 

下图为NutriFreez™ D10冻存液适用的细胞类型：

▲ 细胞类型应用举例

 

Biological Industries使用不同细胞对NutriFreez™ D10冻存液与市面上一些冻存液进行了比较实验：

1. hMSC-BM

Biological Industries使用NutriFreez™ D10冻存液与市面上其他两种冻存液对hMSC-BM细胞的存活率进行了比较：

       

▲ 存活率                                                                               ▲ 增殖率

▲ 细胞形态

如图所示，所有不含血清的冻存液的细胞存活率都大于94%。然而，用NutriFreez™ D10冷冻保存的hMSC-BM细胞在生长3天后比其他产品更好的复苏率，同时可以保持正常的细胞形态。

2. MSC
MSC细胞的存活率比较：

    

▲ 通过台盼蓝排除法测定存活率 

    

    ▲ 通过Annexin V/PI染色流式细胞仪分析存活率

通过图示我们可以观察出，NutriFreez™ D10冻存液的细胞存活率优于自制和其他品牌。
 

复苏后6天细胞增殖率：

▲ 细胞增值率 

同一来源的间充质干细胞显示使用NutriFreez™ D10冻存液的增殖率优于其他产品和自制的冻存液。

复苏6天后的细胞形态：

▲ 细胞形态图

同一来源的间充质干细胞复苏后形态恢复正常。

3. hESC

使用NutriFreez™ D10对hESC进行冻存，如下图是解冻后第1，2-4天的细胞形态和贴壁情况，表明了hESC有良好的复苏率。

▲ 细胞形态图

hESC（ H1）复苏后多能性表面标记物表达

▲ 标记物表达

hESC（H1）复苏后细胞形态随时间恢复良好，多能性hESC表面标志物表达水平正常（A，B）。

 

相关资质

Biological Industries同时也委托WiCell做了相关资格测试。

WiCell---美国领先的hESC细胞库之一

WiCell测试表明在不影响未分化状态和解冻后扩增速率的情况下，用NutriFreez™ D10冻存液冻存的人多能干细胞在细胞的增殖、分化、形态及核型未受影响。

 

   低温冻存技巧   

冷冻凝固的过程中，水分会在0℃~-20℃区间形成不同形状的结晶

在细胞冻存时“降温速度、冰晶形成量和细胞渗透压改变程度”是冻存成功与否的重要关键。

降温速度慢：冰晶由细胞外开始形成，造成胞外渗透压变小，细胞内水份移动至细胞外造成细胞脱水。

降温速度快：水分流动时间短，细胞内外渗透压改变程度小，但大量水分留在细胞内造成大量胞内冰晶形成，使得胞器损坏。

这些都可能引起细胞损伤、凋亡或坏死，也可能造成复苏后细胞存活率低、细胞形态改变、细胞功能丧失、基因变异等现象。

由此可知，最适合的冻存条件为“在增加细胞渗透压稳定性的溶液中，以慢到能减少胞内冰晶形成，但也足够快到能预防细胞脱水的降温速度冻存细胞”。

 

慢冻快融

慢冻→两种办法：

手动降温：将细胞依序放在4℃（30分钟）、-20℃（1小时）、-80℃（过夜）后移至液氮中保存。

程序降温盒：是一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器，使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。

	程序降温	手动降温
优点	主动监控温度 一些控制速率的冷冻机不需要任何可消耗的制冷剂	不需要任何特殊器皿 成本低
要求	受控速率冻结装置 适当的存储瓶 专门的冷冻溶液	专门的冷冻溶液 -80℃冷冻机 液氮罐
长时间保存	液氮或低温储存（只要低于-135℃即可）	液氮

由此可以看出，程序降温精准度更高，优于手动降温。

大家可以根据实验条件选择不同的冻存方式。

快融：

将冻存在液氮中的细胞冻存管快速移至已37℃预热的水浴锅中（水面需低于管口，避免水分意外进入冻存管造成潜在污染），使细胞冷冻悬液迅速融化；此做法能让细胞冷冻悬液快速通过-20℃~0℃这个结晶形成温度范围，避免冰晶进入细胞形成再结晶，对细胞造成二次伤害。

FAQ

问 题	建 议
有毒的冷冻保存液	根据制造商的说明使用商业上可获得的和定义的介质。解冻后立即取出冷冻保护剂。避免细胞在室温中置于低温保护介质中。
不适当的冷却速率	使用-1℃/min的逐渐冷却速度。要达到这个速度，可以使用保温的冷冻容器或控制速度的冷冻机。
冷冻后的温度变化	保持细胞在-130℃后的低温。运输时要将细胞放在干冰上，并确保液氮中有充足的液氮。
不当的解冻速率	细胞必须迅速解冻，使用37℃的水浴解冻冻存管。
不正确的细胞密度	根据不同的细胞类型选择冻存的细胞密度。典型的细胞密度冻存密度是1-10*106cells/ml。 必要的话，要进行细胞最佳冻存密度测试。

Reference  

1. Ultralow storage temperatures suspend all molecular processes and prevents free radical generation that negatively effects cryopreserved cultures(Baust J., 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015).

2.  Mizrahi A, Moore GE, Appl Microbiol. 1970 Jun; 19(6):906-10 Merchant DJ, Hellman KB, Schneider H, Muirhead EE.

3.  Baust J., 2007; Van Buskirk, 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015; Allegrucci & Young.

4. Data Acknowledgment: Prof. Shirley H.J. Mei and research team Yuan Tan and Mahmoud Salkhordeh, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hosptoal Research Institute(Ottawa, Canada).

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