常有用户提到细胞状态不好，比如：细胞不再透亮，内部有很多细碎的小黑点，细胞形态不规则，培养液变黄……这时，除了考虑血清和细菌污染的问题，细胞老化也不容忽视~ 

何为细胞老化？

1882年，德国生物学家Weismann曾大胆预测“在细胞水平存在老化现象”。他推测：机体的寿命限制受控于体细胞的分裂能力；在遗传进化中，不同物种的体细胞获得了不同分裂的潜能，从而决定了不同物种的寿命长短。20世纪50年代，Swin和他的同事利用原代细胞体外培养试验证明了来源于不同物种的纤维细胞均不具备无限分裂的潜能。取得突破性进展的还是Hayflflick和Moorhead，他们做了更系统更细致的观察和描述，他们对25株人成纤维细胞进行原代培养，在这个过程中发现，经过约50次传代之后，所有细胞出现功能退化，并且丧失分裂能力的现象。此后人们将这一现象称之为“Hayflflick极限”或者自发性老化。之后也有事实证明，细胞老化并不是体外培养所导致，细胞在体内也会随着年龄的增长，逐步走向老化。 

细胞老化的基本特征？

长期的细胞周期阻滞是老化细胞的基本特征，也是体外鉴定细胞老化不可或缺的指标。为了检查细胞是否跃出了细胞周期，人们通常检测增殖指示分子Ki-67的表达丰度；或者通过将与胸腺嘧啶相似的溴脱氧尿嘧啶（Bromodeoxyuridine，BrdU）掺入到细胞培养基中，观察是否有新的DNA合成。细胞老化主要表现为G1期阻滞，个别情况下也可伴随G2/M期周期阻滞，或直接由G2/M期阻滞诱发形成。  虽然由于细胞周期的中断和DNA复制的停止，老化细胞内的DNA含量与正常细胞类似，但 RNA与蛋白质丰度均比正常细胞要明显升高。这是因为，尽管细胞进入老化阶段后蛋白质的整体合成速率降低，但是蛋白质的降解体系受到更加明显的抑制，导致蛋白质在细胞内持续堆积。但，由于不同组织来源的细胞，其形态本就各不相同，因此，目前还并无客观的、统一的标准从细胞形态判断并定义老化细胞。换句话说，目前并不能直接根据细胞的形态去判断是否老化细胞。无论是原代细胞或是细胞株，在细胞培养过程中细胞老化现象是存在且常见的，但却容易被操作人员忽略，老化的细胞会出现的特征包括：细胞增殖变慢、细胞核体积异常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、细胞体积增大、细胞扁平、细胞质中出现空泡等现象。
 

总结如下

• （1）细胞老化最开始的现象通常为细胞内部会出现空泡（可能是凋亡小体），也可能会出现黑点，大多沿细胞周边排布，内部中间也可能会显现一些，但相对周边较少；
• （2）老化的细胞会出现细胞体积缩小，胞质浓缩，胞膜起泡，皱缩等现象；
• （3）老化以后的细胞会出现立体感慢慢消失，开始成扁平状，细胞与细胞之间的间隔减小或混在一起，细胞不再是梭形，而会成为各种不规则形状；
• （4）细胞折光性变差，镜下可见细胞“变薄”，做转染实验时，细胞死亡率会较高，但培养液不会发生迅速变黄的现象，仍清亮。（如果是细菌污染的话，一般会出现培养液的迅速变黄，混浊，镜下可见大量繁殖的细菌；若是支原体污染的话，细胞也会失去正常形态，会有细胞的死亡）；
• （5）细胞的贴壁性减弱，开始有细胞漂浮在培养液中；
• （6）老化的细胞表面分泌物会增多，细胞表面的纯净度越来越低；
• （7）分裂的细胞数量明显的减少，同时细胞的增殖速度也会大大下降； 
• （8）细胞开始长角分化。

 如下图：

▲ 图1 HEK293细胞                                                ▲图2 MSC细胞

图1  实心箭头指示的是发生细胞老化的HEK293细胞，SA-β-gal染色阳性，而空心箭头指的是未发生老化的细胞。

图2  被染上蓝色的是发生老化的MSC细胞, 未被染色的是未发生老化的细胞。

由图片可以看出老化细胞体积增大、细胞扁平。
 

细胞培养中如何预防老化？

• （1）防止细胞老化最主要还是要做到勤观察、勤换液、勤传代、勤保种，特别是传代，不能等细胞太密了之后传，一般细胞建议长到70％融合度传代最好；
• （2）换培养液应该根据自己细胞消耗培养基的情况来确定是否该换。如果感觉时间不好把握的话就多培养几瓶细胞，在不同的时间换液，最后再来比较下，看什么时候换液好，得出自己的结论；
• （3）选择正确的血清与培养基：细胞对血清特别敏感，直接影响细胞的生长。一定要选择适合的血清不然就会因营养物质不协调而导致细胞老化；
• （4）在间充质干细胞培养时必然要进行消化，但是消化对细胞的表面蛋白质有很强的破坏作用，因此不能长时间进行消化并且在选择消化酶时也要选择较为合适的pH和浓度，不然就会使细胞老化或者分化； 
• （5）在开始养细胞并传代时，也要特别注意冻存细胞，以保持细胞有种子库存在，可以有效避免细胞损伤。
   

虽然，老化细胞不会立即死亡，但其基因表达会发生变化，如果细胞老化现象严重，建议从种子库或工作库重新复苏细胞。在进行细胞培养时，我们经常会听到一些专业名词，原代培养是什么？什么是世代数？细胞系是什么？有限细胞系又代表的是什么？有的专有名词搞不清楚的话，会对细胞培养过程也会有一定的影响。根据老师们的反馈，我们总结了以下容易混淆的概念供大家参考~ 

1、原代培养（Primary culture）

开始于直接取自生物体的细胞、组织或器官的培养称为原代培养。通常代表异质细胞群，很难标准化和繁殖。它们的寿命一般有限，而且已知它们会随着时间而改变其差异特征。

2、传代（Passage(Subculture)）

细胞从一个皿里转移或传代到另一皿里的过程称为细胞传代。这是一个操作行为，无法准确定义细胞分裂次数。

3、传代次数（Passage number）

一种细胞被传代培养的次数称为传代次数。

4、世代数（Generation number）

一种细胞所经历的细胞数量倍增次数称为世代数。

5、群体倍增时间（Population doubling time）

在对数生长期中期细胞数量翻倍所需要的时间间隔称为群体倍增时间。

6、群体倍增次数（Population doubling）

在培养过程中细胞所经历的细胞数量倍增次数称为群体倍增次数。

7、细胞系（Cell line）

原代细胞经过第一次传代后增殖的细胞称为细胞系或亚克隆。随着细胞的传代，生长能力最强的细胞会占据优势，最终导致细胞群体在基因型和表现型上达到一定程度的均一性。

8、细胞株（Cell strain）

细胞系通过选择或克隆获得的具有特征的细胞系称为细胞株。与亲代细胞系起始时相比，细胞株往往会获得其他一些遗传学改变。

9、有限细胞系（Finite cell line）

通过传代增殖但在体外只能增殖有限细胞数量的一种细胞称为有限细胞系（通常60-70倍增次数）。

10、衰老（Senescence）

与染色体端粒缩短相联系的生物调控的增殖潜力损失称为细胞衰老。存活的细胞也可能保留一些功能活性。

11、永生化（Immortalization）

获得无限的寿命，可能是细胞自发产生的，也可能是以转染引起的。

12、无限细胞系（Infinite/immortal/strain）

具有无限增殖能力的细胞系或细胞株称为无限细胞系/连续细胞系。

13、平板效率（Plating efficiency）

在传代培养中产生集落的细胞的百分比称为平板效率。如果每个集落都可以说是来自一个细胞，那么平板效率等同于克隆效率/集落形成效率。有时，平板效率被粗略地用来描述传代培养后存活的细胞数量，但这被更好地称为种子效率。

 Reference：

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