如何用正确的方法进行细胞计数？

很多小伙伴们在细胞培养过程中会有这样的疑问，“我计数的细胞数量准确吗？”今天我们就来聊一聊如何进行细胞计数。

在进行细胞计数之前，我们先来了解一下血细胞计数板的构造。

血细胞计数板的构造

血细胞计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有4条下凹的槽，槽与槽之间构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半靠近横槽一边上面刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格（见图1C），其中只有中间的一个大方格为计数室，供细胞计数用。计数室通常有两种规格：一种是大方格内分为25个中方格（中方格之间用双线分开，见图1D），每一中方格又分为16 个小方格；另一种是大方格内分为16个中方格，每一中方格又分为25个小方格。不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=400个小方格组成（见图1D）。

图1. 血细胞计数板的构造

注：计数室边长为1 mm，面积为1 mm² ，每个小方格的面积为1/400 mm²。盖上盖玻片后，计数室的高度为0.1 mm，所以其体积为0.1 mm³ ，每个小方格的体积为1/4000 mm³。

01实验材料

无 菌：DPBS、0.25%胰蛋白酶、吸管、完全培养基。

非无菌：移液器、20 μl或100 μl 可调式、血细胞计数板、95%乙醇溶液或无水乙醇、0.4% 台盼蓝溶液（BI货号：03-102-1B）、数字计数器、普通显微镜。

 

02实验原理

在细胞培养工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞是否存活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞活力和增殖状况，如胰酶消化制备的细胞悬液中细胞存活率确定，冻存细胞复苏后的活力检测等。

存活测试的原理为染料排除实验，利用染料会渗入死细胞中而呈色，因活细胞细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用台盼蓝染料，如果细胞不易吸收台盼蓝，则用赤藓红B。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼蓝染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼蓝与蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。

 

03实验内容与方法

1. 制备动物细胞悬液

细胞悬液制备方法是用DPBS液洗涤、0.25%的胰蛋白酶消化后，加入完全培养基（或Hanks液，PBS或DPBS等平衡盐溶液），轻轻吹打混匀，制成待测细胞悬液。

2. 细胞计数

• 计数板处理

  在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。将清洁干净的血细胞计数板的计数室上加盖专用盖玻片。

• 染色

  用滴管吸取0.4%台盼蓝染液（BI货号：03-102-1B），按1∶1比例加入细胞悬液中，轻轻吹打混匀。将细胞悬液滴于盖玻片边缘，使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则要重做。稍候片刻，将计数板放在低倍镜下（10×10倍）观察计数。

• 计数方法

  按图计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计上线细胞不计下线细胞，计左线细胞不计右线细胞。两次重复计数误差不应超过±5%。镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。

• 计数换算

  计完数后，需换算出每毫升悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为 0.01 cm²，高为 0.01 cm，这样它的体积为0.0001 cm³，即0.1 mm³=1×10⁴ ml，所以每一大方格内细胞数×10⁴=细胞数/ml，故可按下式计算：细胞悬液细胞数 /mL = （四个大格细胞总数 /4）×2×10⁴。公式中乘以2，是因为细胞悬液于台盼蓝染液是1：1稀释。如计数前已稀释，可再乘稀释倍数。计数细胞后，计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。

• 示例
  T75 单层培养，制成10 ml细胞悬浮液，取0.1 ml溶液与0.1 ml 台盼蓝混合均匀于离心管中，取少许混合液加入血细胞计数板，计数四大方格内的细胞数目。

• 活细胞数/方格：55，62，56，60；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=251

• 平均细胞数/方格=62.75；稀释倍数=2；
  细胞数/ml：62.75×10⁴×2（稀释倍数）=1.26×10⁶；
  细胞数/flask（10 ml）：1.26×10⁶×10 ml=1.26×10⁷

• 存活率：233/251﹦92.8%

注意事项 

• 滴细胞悬液时要干净利落，加量要适当，过多易使盖片漂移，或淹过盖片也会失败，应重做；过少易出现气泡；不理想时，应重做。

• 镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均匀，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将细胞悬液进行混合，再重新计数。

• 计数时，对于位于边线或交界处的细胞/细胞团，遵循“计上不计下，计左不计右”的规则。

• 一个细胞团计做一个细胞。

• 计数板计数时，最适浓度为5～10×10⁵细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。如果细胞数目很少则要进行离心再悬浮于少量培养液中。

图2. 细胞计数示意图（图源网络）

 

血细胞计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗刷后自行晾干或者用吹风机吹干，或用95%乙醇，无水乙醇等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗，直到干净为止。

 

1. 人工失误（混匀、加样、稀释、计算错误以及人工操作误差）。

2. 多次计数以保证结果准确的必要性。

3. 细胞均匀分布的要求。

4. 仪器及材料差异（栅格，深度，盖玻片，缓冲液类型以及移液器）。

血细胞计数板几百年来在生物医学研究中一直都是一个必备的工具，并且经历了很多的改进才形成了今天研究者们使用的样子，但还是会有很多不可避免的计数误差。

如今，现代化自动细胞计数仪的使用已经很大程度上消除了许多引起误差的情况，提高了细胞计数的准确性和效率。

目前，市面上也有多种品牌的自动细胞计数仪，有基于细胞图像的，也有基于Coulter原理的，但是主要目的就是将实验人员从繁冗无聊的手工计数中解放出来，排除操作者的主观性。

 

如何选择推荐细胞计数仪

1. 要考虑细胞计数仪的性价比：如果您的目的只是代替手工计数，节省操作者的时间，操作简便，则完全没有必要花费较多的经费买一台仅能进行细胞计数的仪器，花大钱办小事。

2. 要考虑细胞计数仪的稳定性和重复性：如果您对细胞计数的准确性和重复性要求高，那仪器的高性能和稳定性是首要考虑因素，还要考虑仪器的硬件以及配套软件的稳定性，不能一味的追求低价格。

3. 要考虑根据细胞类型选择适合的型号：如果您的样本是原代细胞，背景复杂，红细胞和血小板污染严重，您又希望快速精确计数有核细胞且进行精确细胞活力分析，计数结果的准确性直接影响后续实验的成功和重现性。那么双荧光细胞计数&活力分析仪将是帮您解决问题的有力装备。

4. 要考虑实验室多功能检测需求：如果细胞计数和活力分析只是实验室的部分需求，而实验室还要进行凋亡、细胞周期、GFP等功能检测，且实验室也无配套的仪器，那为实验室装备一款多功能的细胞计数仪是您的最佳之选，省时，省力可以轻松、简单、随时亲自操作获得理想结果。

大家可以根据自己的实际情况进行比对选购哦！

 

References

1. 沈萍, 范秀容, 李广武. 微生物学实验[M]. 第3版. 北京: 高等教育出版社, 1999: 90～92.

2. 李洪臣, 杨秀艳. 使用血细胞计数板测定微生物数量实验的改进[ J ]. 生物学通报, 2007, 42 (7) : 22.