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细胞培养之秘密花园篇
人阅读 发布时间：2021-07-07 14:06
众所周知，细胞培养中最常见的组合就是基础培养基+血清了。随着科研的深入，无血清细胞培养基应运而生，它添加了血清的主要成分：粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等，能减少血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定。然而在细胞培养中，常常被大家所忽视的细胞培养辅助试剂也发挥着举足轻重的作用。今天小编就带您来探索一下细胞培养的秘密花园——细胞培养辅助试剂。
秘密花园之胰酶篇
使用胰酶，你必须要注意的事情
❤ 胰酶的作用原理是什么呢？
胰酶是一种蛋白酶，酶切位点是肽链的Lys或Arg两个残基的羧基端肽链，通过在特定位置上降解蛋白，使细胞膜上和培养皿结合处蛋白降解，从而使两者分离。这时细胞在自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力的作用下成为球形。
❤ 使用胰酶时需注意哪些细节问题？
在使用胰酶（Trypsins）细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差，做流式时的CD Marker也可能会下降。胰酶进行分装时尽量分装成多瓶，并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时液体体积会膨胀，多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并可能造成污染。胰酶适用于消化细胞间质较少的软组织和传代细胞，如胚胎、上皮、肝、肾等组织，但对于纤维性组织和较硬的癌组织效果较差。胰酶消化效果主要与pH值、温度、胰酶浓度、组织块大小和硬度有关。
注意：不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才表示消化好了。
一般肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙状移动就可以了，这时就应该停止消化。
❤ 如何选择正确的细胞消化试剂？
BI提供动物来源的传统胰酶及基因工程生产的重组胰蛋白酶。
动物胰酶普遍用于血清培养，不同的细胞加入胰酶的成分和浓度不一样。贴壁不牢和半贴壁细胞尽量使用浓度0.05%不含EDTA的胰酶且不需要放在培养箱孵育，这样易于控制，对细胞的伤害也降到最低。对于难消化的细胞就需要使用含EDTA的0.25%的胰酶，而不是无限地延长消化时间。重组胰酶用于无血清培养。重组胰酶具有与动物源性胰蛋白酶相同的酶学性质，但是不含任何动物源成分，可替代胰蛋白酶使用（常用于细胞治疗）。
❤ EDTA和胰蛋白酶各有什么作用呢？
许多人不用胰蛋白酶，只用EDTA，或者用胰蛋白酶/EDTA联合作用。胰酶切割ECM（负责粘连和附着的蛋白），而EDTA通过螯合Ca2+，抑制Integrin的贴壁活性，所以EDTA的作用更加温和。
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普通胰酶：
特殊胰酶：
温馨提示：重组胰酶室温保存即可噢~
答案是否定的，细胞培养时不应常规使用抗生素，因为连续使用抗生素会促进抗生素耐药性细胞株的产生，导致轻度污染持续存在。一旦将抗生素从培养基中去除，这种轻度污染最终将发展成大规模污染，而且连续使用抗生素还会掩盖支原体感染及其他隐性污染。另外，有些抗生素会与细胞发生交叉反应，影响细胞生化，并可能改变培养细胞的分化潜能，干扰研究过程。抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤除。如果长期使用抗生素，则应同时进行无抗生素培养，以便作为鉴别隐性感染的对照。
❤ 原代细胞里加双抗或者三抗，会不会影响细胞生长？
分离原代细胞初期，为了避免造成污染，一般会建议预防性加入适量双抗或者三抗，适量的抗生素用量对细胞的生长几乎没有影响，可以在细胞培养稳定后降低或移除抗生素。
❤ 青霉素（Penicillin）、链霉素（Streptomycin）的抑菌原理是什么？
青霉素通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交连桥的结合而阻碍细胞壁合成并发挥杀菌作用，对革兰阳性菌有效，但革兰阴性菌缺乏五肽交连桥，因此青霉素对其作用不大。链霉素作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌蛋白质合成，对革兰阴性菌有效。青链双抗 (Penicillin-Streptomycin Solution, Cat#：03-031-1B)联合抑制细菌，可以有效杀灭G+、G-菌。
❤ 青链制真菌素三抗溶液（Penicillin-Streptomycin Nystatin Solution, Cat#：03-032-1B），融解后会有黄色物质析出，属于正常现象吗？
三抗本身是浓缩溶液，制真霉素在高浓度饱和状态水溶性差会被析出呈黄色物质，溶液外观略显浑浊，属于正常现象，可以放心使用。
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与任何冷冻溶液一样，在Nutrireez™D10培养基中长期低温保存在-196°C或液氮中最有效。由于长时间暴露于DMSO中，在-20°C / -80°C中存储可能会影响细胞活力，而在液氮(-196°C)中保存细胞可以改善这一影响。
❤ 冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后，须立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
❤ 为什么需要无动物成分(ACF)细胞冻存溶液?
血清是一个“黑匣子”，它包含了许多不需要低温保存的成分，甚至可能在冷冻和解冻过程中伤害细胞。ACF溶液除了可重复性和一致性外，还能提高活力和回收率。
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L-谷氨酰胺是细胞培养中细胞进行能量生成以及蛋白质和核酸合成所必需的一种营养素。L-谷氨酰胺不稳定，在中性溶液中会自发降解，降解率随保存温度而变。细胞培养基中的L-谷氨酰胺降解后生成的副产物是氨和焦谷氨酸，而氨对于一些细胞具有毒性（对干细胞，原代细胞的影响尤其大）。
1. 选择不含谷氨酰胺的培养基，自己添加。
2. 选择稳定的谷氨酰胺替代物——L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液。
❤ L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的工作原理是什么？
在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培养基中培养细胞时，细胞可逐渐释放氨肽酶，水解二肽，缓慢释放L-谷氨酰胺和L-丙氨酸至培养基中。随后，L-谷氨酰胺和L-丙氨酸可被细胞吸收，用于蛋白质生成或TCA循环。这好比是流加培养的策略，将L-谷氨酰胺连续加入培养基中，但是始终维持较低的浓度水平。结果获得有效的能量代谢和较高的生长量，且不会生成多余的氨。
△ L-谷氨酰胺以一种可控的方式从培养基输送到细胞
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| 货号 |
名称 |
| 03-020-1 |
L-Glutamine Solution (200 mM) 谷氨酰胺 |
| 03-022-1 |
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) 稳定型谷氨酰胺 |
秘密花园之平衡盐溶液篇
❤ HEPES溶液的具体作用？什么时候需要添加HEPES溶液？
HEPES是一种两性离子有机缓冲液，也用于维持细胞培养基的生理pH值。HEPES广泛应用于许多生化反应中，并在一些细胞培养基中作为缓冲剂。HEPES对细胞没有营养价值。当细胞培养需要在CO2培养箱外进行长时间的操作时，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时需要添加HEPES。神经细胞原代培养的过程中能用到。
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秘密花园之无血清细胞培养添加物篇
激素，胰岛素作为一种多肽激素，对哺乳动物细胞具有多效合成作用，促进葡萄糖和氨基酸摄取、脂肪生成、单价阳离子和磷酸转运、蛋白质和核酸合成。转运蛋白，如转铁蛋白，转铁蛋白作为铁的载体，也有助于降低氧自由基和过氧化氢的毒性水平。ECM因子是某些贴壁生长细胞所必需的组分，如纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白等。
| 货号 |
产品 |
| 05-750-1 |
人纤维粘连蛋白 |
| 41-951-100 |
转铁蛋白（不含铁） |
| 41-952-100 |
转铁蛋白（铁离子饱和） |
| 41-975-100 |
人类重组胰岛素 |
胰岛素-转铁蛋白-Selenious Acid（ITS）通过补充常见营养物质，可以大幅度降低细胞对胎牛血清的需求。在胎牛血清浓度低于4%的情况下，ITS或ITS-E都能促进各种贴壁细胞的生长。研究表明，下列所述补充成分能被大多数哺乳动物细胞所利用。它们能促进细胞增殖，降低多种细胞对血清的需求。据文献资料，细胞培养过程中，当ITS或ITS-E与2%-4%的血清一起使用时，可达到与添加10%血清相似的增殖效果。
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跟着小编探索完细胞培养秘密花园的您，是不是豁然开朗了~
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