血清热灭活？别再浪费时间了！

有必要进行血清热灭活吗？

这可能是很多实验室新手面临的一个问题。

 

血清热灭活目的

 

• 血清热灭活目的主要是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，但是在胎牛血清中对补体的灭活则明显没有必要。

 

• 研究人员曾对商业胎牛血清中的补体成分进行测定，他们发现胎牛血清中含有的C1、C6仅达成年动物血清的1-3%，而其它补体成分仅有成年动物的5-50%，至于补体的主要成分C3在胎牛血清中则几乎不能检出。通过补体固定实验，也未发现有明显的溶血现象。多数实验室在培养前将培养液进行预热的过程，也对热敏的补体有灭活的作用。

 

 

血清热灭活非必要

 

血清热灭活的步骤在1970年代就已建立，至今成为很多实验室的常规血清前处理步骤；但许多先前认为必须热灭活的原因，部分已经不再成立：

 

• 去除支原体污染?
  早期血清加工使用的450 nm滤膜，早已被100 nm滤膜取代；且随着加工技术的创新及严格的监控，血清产品早已没有支原体污染的疑虑。

 

• 去除补体等对热敏感的物质? 
  胎牛血清中含有的补体仅为成年牛血清5-50％，而C3 （补体中引起免疫反应的主成分）在胎牛血清中则几乎不能检出，直接使用血清对大多数的细胞株没有负面影响。

 

 

血清热灭活

对细胞生长无明显帮助

 

细胞生物学家比较了正常热灭活胎牛血清对各种细胞株的生长能力影响，发现11株细胞中，热灭活对6 株细胞有负面影响（红）、3株无影响（绿）、2株有微弱正面改善（黄）（下图1）。

 

▲图1：使用未灭活或灭活血清的细胞生长状况

 

所以，在正常操作下，热灭活通常对“细胞生长”没有明显的促进作用，反而会破坏血清内生长因子，维生素，氨基酸等珍贵物质，降低细胞增殖速度。

 

 

血清热灭活的缺点

 

万一设错水浴温度或忘记按计时器，都会导致过高的加热温度（下图2）或过长的加热时间（下图3），进而大大降低血清的功能，影响细胞生长的表现。

 

▲图２：过高的加热温度降低大多细胞株生长速度

（仅一株未受明显影响）

 

▲图３：过长的加热时间降低大多细胞株生长速度

（仅一株未受明显影响）

 

且灭活加热过程会增加血清的沉淀状况，而沉淀又常常被误认为是微生物的污染，进而耗费大量时间及精力验证是否污染，导致实验一再拖延。

 

 

我的细胞一定要用灭活血清，

怎么办？

 

在灭活过程中，除了需要严格监测加热温度及认真计算时间，还有几个小技巧可以注意噢！

 

• 灭活时，水浴槽水面与血清液面等高。

  使用水浴槽时，大多数人为避免血清瓶浮起来，会减少水浴槽内的水量，让水面降低；数据显示，降低水面也会使瓶内加热不均、拉长加热时间（下图４），增加血清破坏程度；所以还是建议将水浴槽内水量增加，让水面与血清液面等高，让血清最大面积的接触水流，增加灭活效率！

 

▲图４：300ml刻度水位需要60分钟加温；

500ml刻度水位仅需40分钟加温。

 

至于血清瓶漂浮的问题，套上烧瓶用铅环（下图５）就解决啦！

 

▲图５：烧瓶用铅环

 

• 灭活后，使用冷水浴降温！　　

  灭活后如果直接放在室温或4度冰箱冷却，仅靠空气传导散热，冷却效果差（下图６），使得实际降温时间拉长，对血清的影响较大；反之，流动的冷水浴散热速度较快，冷却效果佳，缩短降温时间的同时，也减少对血清的破坏。

 

▲图６：比较冷水浴及４℃冰箱降温速度。

 

本文重点

 

1. 现代血清加工技术进步，热灭活已成为非必要步骤。

2. 热灭活对细胞生长没有明显促进作用，反而会破坏血清、增加沉淀状况。

3. 除非文献指出该细胞必须使用灭活血清，一般细胞培养可省略血清热灭活步骤。

4. 如果必须使用灭活血清，加热时水浴槽水面高度尽量与血清液面等高；灭活后使用冷水浴取代冰箱降温，能减少对血清的破坏。直接选择购买已灭活的血清产品，也是个好选择噢！

 

总之，非必要不灭活~

 

 

All the Data Come From：

Look, N. (1996). Heat inactivation–are you wasting your time. Art to Science.