Master Cell Cryopreservation

掌握细胞冻存

 

细胞冻存有哪些好处呢？

01 节省实验室空间、时间、经费

02 若实验失败，还有重来的机会

03 确保重复实验的一致性

04 确保未来实验的连贯性

但是，经常会有用户反映，细胞冻存与复苏遇到了问题，看来看似简单的一步其实并不简单。

那么如何做好细胞冻存呢？今天跟随我们一起来了解一下细胞冻存时需要注意的事项和技巧吧。
 

细胞冻存的基本原理

细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使代谢活动近乎停止。细胞因此进入休眠状态，使细胞“不会老”，可以长期保存。

因为冻融过程对所有细胞和组织都是有一定伤害的，因此，需要开发出有效的技术来防止细胞死亡和损伤。

Ultralow storage temperatures suspend all molecular processes and prevents free radical generation that negatively effects cryopreserved cultures(Baust J., 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015).

这时，低温保护剂就发挥出它的作用了。

低温保护剂可保护细胞不受细胞内冰冻影响，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等渗透型低温保护剂。它们的作用机制包括：自由进入细胞，取代水，使冰点下降，充当盐的二次溶剂，提高细胞膜对水的通透性。如下图所示：

 

但是，部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞，但它们也会引起细胞毒性，尤其是在室温下。因此，在标准的自制冻存液中，会含有血清，血清是用来降低细胞毒性的，但血清也不是完美的。

如下：

血清的优势	血清的缺点
有助于保护细胞	含有生长因子，激素等未知成分
	不推荐用于细胞库，临床应用
	增加污染几率
	成本波动

那么有无动物源成分替换物吗？

甲基纤维素已被认为是细胞冷冻保存的保护剂，可作为胎牛血清的合适替代物。

1. 化学成分明确

2. 保护性

甲基纤维素结构图Mizrahi A, Moore GE, Appl Microbiol. 1970 Jun; 19(6):906-10 Merchant DJ, Hellman KB, Schneider H, Muirhead EE. 

尽管大多数研究和医学领域都存在优化的冷冻保存方案和已发表的配方，但技术问题依然存在。

 

 

 Baust J., 2007; Van Buskirk, 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015; Allegrucci & Young.

 

如何选择冻存液

首先我们需要明确首要任务是什么？我们的细胞需要什么？

l   回收率？

l   存活率？

l   低温保存培养基成分？

l   无血清或无外源性要求？

l   我需要使用哪个方法？

l   商业培养基相比于自制培养基的优势？

 

Biological Industries推出了一种即用型，无动物源成分的冻存液：

 

下图为NutriFreez^® D10冻存液适用的细胞类型：

Biological Industries使用人间充质干细胞（hMSC）、人多能干细胞（hPSC）和一些其他的细胞系对NutriFreez^® D10冻存液进行了验证实验：
 

人间充质干细胞（hMSC）

Biological Industries使用NutriFreez^® D10冻存液与市面上其他两种冻存液对hMSC细胞的细胞形态及存活率进行了比较：

存活率                                                      细胞数量对比

 

细胞形态

如图所示，用NutriFreez^® D10冷冻保存的hMSC复苏当天的存活率为95%；复苏后3天的细胞数量增加超过7倍，细胞在生长3天后比其他产品更好的恢。

我们比较了用D10冻存液和另外两种冻存液冻存的人间充质干细胞，复苏后的细胞增殖状况和形态。对比可知，D10冻存液冻存的细胞复苏后具有更高的细胞密度和正常的细胞形态。

1.hMSC低温保存复苏后的增殖和形态比较：

hMSC-BM（左图）；hMSC-AT（右图）

如图，是人间充质干细胞在D10冻存液中冻存不同时间，复苏后的存活率比较。从结果可以看出，人骨髓来源的间充质干细胞和脂肪来源间充质干细胞在D10冻存液中冷冻保存3年后相比于保存一年半仍然具有很高的存活率。

2. 各种hMSC在NutriFreez^®  D10培养基中低温保存复苏后的存活率比较：

接下来是各种人间充质干细胞在用D10冻存液冻存，复苏后的存活率比较。可见来自脂肪组织（AT）、骨髓（BM）和牙髓（DP）的间充质干细胞，复苏当天与复苏3天后的存活率没有明显差异。

3. 不同类型hMSC在NutriFreez^® D10培养基中低温保存后的形态比较：

如图所示，是各种人间充质干细胞在D10冻存液中冻存复苏后的形态比较。脂肪（AT）、骨髓（BM）和牙髓（DP）来源的间充质干细胞，复苏当天与复苏3天后的形态均正常。

4. 表面标志物表达分析：

多种人间充质干细胞用D10冻存液冻存，复苏后，通过流式细胞荧光分选技术分析，依然保持表面标志物表达。

5. hMSC细胞的存活率的比较：

通过台盼蓝排除和膜联蛋白V / PI染色结合流式细胞仪分析对自制和其他品牌冻存液冻存的细胞进行复苏后活力比较。与自制和竞争品牌相比，用D10冻存液冻存的原代人间充质干细胞复苏后表现出最佳的存活率，此外还提高了细胞粘附和生长性能。

6. 在解冻后6天细胞复苏率对比：

相比之下，在NutriFreez^® D10冻存液中保存的原代人间充质干细胞（来自健康供体）在解冻后的回收率最高，此外还提高了细胞的粘附和生长性能。复苏后第6天表现出最佳的复苏率。
 

人多能干细胞（hPSC）

1. 复苏后形态对比：

如图所示，人多能干细胞在NutriFreez^® D10培养基中低温保存复苏后表现出更好的恢复和形态。

细胞克隆效果显著，细胞集落形态正常，表现出更好的复苏效果。
 

2. 分化潜能分析：

利用 hematoxylin -伊红染色法对自发形成的18天后的胚状体进行组织学切片染色鉴别人胚胎干细胞。hPSC在D10冻存液冻存，复苏后仍能保持多项分化潜能。

3. 单细胞附着能力分析：

用D10冻存液冻存，复苏后观察单细胞复苏，形态和附着。ACS-1019细胞和附着能力强。

4. 标志物表达：

在不影响人胚胎干细胞复苏后未分化状态和膨胀率的情况下，验证性研究用D10冻存液适当低温冻存人多能干细胞的能力。未分化的人多能干细胞中Oct3/4和SSEA4标志物表达超过85%。

5. 验证性研究

在不影响hPSC解冻后未分化状态和膨胀率的情况下，低温保存hPSC的能力。

核型分析分辨率为500-550条带时未检测到克隆异常，这是正常的核型。

研究证实，使用D10冻存液冻存的hPSC，复苏后细胞增殖、分化、形态或核型没有受到影响。D10冻存液符合WiCell干细胞库的质量要求，当按照指导使用时，适合用于hPSC的低温保存。

 

与在自制冻存液冻存的细胞相比，用D10冻存液冻存的外周血单核细胞，复苏后的存活率高达91%。

2. 人脐静脉内皮细胞：

用D10冻存液冻存，复苏后表现出94%的存活率和较高的细胞产量，复苏第4天后人脐静脉内皮细胞形态正常。

用抗内皮细胞表面CD31、CD144和CD90的抗体标记脐静脉内皮细胞并用D10冻存液冻存，复苏后，通过流式细胞仪检测，依然维持表面标记物的表达。

3. 人真皮微血管内皮细胞：

存活率                                      细胞形态

人真皮微血管内皮细胞用D10冻存液冻存，复苏后存活率高达96%。复苏后第4天保持正常细胞形态。

4. 多种细胞系不同时长存活率比较：

多种细胞系用D10冻存液冻存不同时长，复苏后的存活率比较，相比冻存6个月，冻存4年的细胞复苏率略有下降，但依然处于较高水平。

5. 多种细胞系存活率及贴壁率比较：

据图可知，不同细胞系的贴壁率和存活率有明显差异；同一种细胞系，用D10冻存液冻存比用自制冻存液冻存，复苏后的贴壁率和存活率更高，意味着D10冻存液具有更好的冻存效果。

 

资 质

Biological Industries同时也委托WiCell做了相关验证测试。

WiCell---One of the leading hESC cell banks in the United States

WiCell测试表明在不影响未分化状态和解冻后扩增速率的情况下，用NutriFreez^® D10冻存液冻存的人多能干细胞在细胞的增殖、分化、形态及核型无影响。

 

低温冻存技巧

冷冻凝固的过程中，水分子会在0℃~-20℃区间形成不同形状的结晶。

 

在细胞冻存时“降温速度、冰晶形成量和细胞渗透压改变程度”是影响冻存成功的关键因素。

降温速度慢：冰晶由细胞外开始形成，造成胞外渗透压变小，细胞内水分移动至细胞外造成细胞脱水。

降温速度快：水分流动时间短，细胞内外渗透压改变程度小，但大量水分留在细胞内造成大量胞内冰晶形成，使得胞器损坏。

 

这些影响都会让细胞损伤、凋亡或坏死，也可能造成复苏后细胞存活率低、细胞形态改变、细胞功能丧失、基因变异等现象。

 

由此可知，最适合的冻存条件为“在增加细胞渗透压稳定性的溶液中，以慢到能减少胞内冰晶形成，但也足够快到能预防细胞脱水的降温速度冻存细胞”。

慢冻快融

慢冻→两种办法：

手动降温：将细胞依序放在4℃（30分钟）、-20℃（1小时）、-80℃（过夜）后移至液氮中保存。

程序降温盒：是一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器（填充异丙醇或依靠特制金属导热），使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。
 

	程序降温	手动降温
优点	主动监控温度 一些控制速率的冷冻机不需要任何可消耗的制冷剂	不需要任何特殊器皿 成本低
要求	受控速率冻结装置 适当的存储瓶 专门的冷冻溶液	专门的冷冻溶液 -80℃冷冻机 液氮罐
长时间保存	液氮或低温储存（只要低于-135℃即可）	液氮

由此可以看出，程序降温精准度更高，优于手动降温。

大家可以根据自身情况或者实验条件选择不同的冻存方式。

快融：

将冻存在液氮中的细胞冻存管快速移至已37℃预热的水浴锅中（水面需低于管口，避免水分意外进入冻存管造成潜在污染），使细胞冷冻悬液迅速融化，此做法能让细胞冷冻悬液快速通过-20℃~0℃这个结晶形成温度范围，避免冰晶进入细胞形成再结晶，对细胞造成二次伤害。

FAQ：

问 题	建 议
有毒的冷冻保存液	根据制造商的说明使用商业上可获得的和定义的介质。解冻后立即取出冷冻保护剂。不允许细胞在低温保护介质中保持室温。
不适当的冷却速率	使用-1℃/min的逐渐冷却速度。要达到这个速度，可以使用保温的冷冻容器或控制速度的冷冻机。
冷冻后的温度变化	保持细胞在-130℃后的低温。运输时要将细胞放在干冰上，并确保液氮罐被正确地装满。
不当的解冻速率	细胞必须迅速解冻。使用37℃地水浴解冻冻存管
不正确的细胞密度	根据不同的细胞类型选择冻存地细胞密度。典型的细胞密度冻存密度是1-10*106cells/ml。 必要地话，要进行细胞最佳冻存密度测试。

 

References 

1.  B. Liu, et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-23320-8. 

2.  N. Aydoğdu, et al. Isolation, Culture, Cryopreservation, and Preparation of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells as a Final Cellular Product Under Good Manufacturing Practices–Compliant Conditions. Methods in Molecular Biology. (2020) Springer, New York, NY. https://doi.org/10.1007/7651_2020_332. 

3.  R. E. Burnham, et al. Human serum albumin and chromatin condensation rescue ex vivo expanded γδ T cells from the effects of cryopreservation. Cryobiology, 2021, ISSN 0011-2240, https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2021.01.011.

4.  S. Reichman, et al. Compositions and Methods for Efficient Amplification of Retinal Progenitors Cells. US Patent App. 16/976581, 01/07/2021. 

 

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