细胞养着养着就变样了，状态不好“生病了”，怎么办？
教您细胞界的“望、闻、问、切”，给您的细胞“把把脉~”
 

细胞状态不好，总结下来可以从以下几点出发考虑：
导致细胞污染的原因主要有以下几方面：
1. 环境：水浴锅、培养箱水盘、细胞培养箱内壁、超净台、桌面及试剂瓶身、细胞房空气消毒。
2. 操作：细胞复苏、传代、冻存等过程中也可带入污染。
3. 试剂：血清、基础培养基、胰酶、辅助试剂、营养添加物等。
4. 耗材：培养皿或培养瓶、枪头。
5. 细胞本身：本身携带污染、细胞老化、分化等。
接下来我们按照此步骤一步步进行分析：

环境
环境需要考虑到的因素有：
水浴锅、培养箱水盘
由于长期处于潮湿状态，水是一个很重要的污染源，建议两周更换一次高压灭菌水。并且添加水浴锅专用消毒预防试剂（Aquaguard-2，货号: 01-916-1E）和培养箱水盘（Aquaguard-1，货号: 01-867-1B）专用消毒预防试剂。

Aquaguard-1
用来消毒培养箱中的水盘，可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒；无毒；对不锈钢无腐蚀性；不挥发。
用法：
1. 培养箱建议每两周进行一次系统地清洁和消毒。
2. 稀释100倍即可使用，即将1L水中加入10ml的Aquaguard-1溶液。

Aquaguard-2
用来消毒水浴锅，可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒。
用法：
1. 建议每周进行一次系统地清洁和消毒水浴锅。
2. 稀释500倍即可使用，即将1L水中加入2ml的Aquaguard-2溶液。
●  细胞培养箱内壁：每星期需要清洁一次，保持洁净状态。每年对CO₂、温度探头校准一次。
●  超净台、桌面及试剂瓶身：要经常擦拭，以防带入外源污染。
●  细胞房空气消毒：可选择紫外杀菌、甲醛熏蒸、过氧化氢干雾灭菌、臭氧灭菌等方法彻底清洁细胞房空气，每种方式各有优缺点、可综合考虑及比较后择优使用。
培养箱内壁、超净台、桌面及试剂瓶身都可考虑使用：

Pharmacidal™ Sprays and Solution 消毒喷壶溶液
 

主要成分：Pharmacidal 是由筛选过的有机氮化合物组成，主要组成成分为：苄基二甲基辛基氯化铵、苄索氯铵、三羟乙基胺，并添加丙二醇等清洁消毒剂。
作用原理：Pharmacidal作用方式是使脂质变性，分解细胞膜的双层磷脂质和增加细胞通透性，导致酶的灭活，蛋白质沉淀，与DNA和RNA产生反应。
特点：
1. Pharmacidal 对大部分的细菌、芽孢、支原体、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒都有效。
2. 不含汞、甲醛、酒精，可生物降解、无毒、无刺激，对一般的工作台面和器材没有腐蚀性和任何损伤。
使用方法：
1. 可消毒橡胶手套、超净台面、桌面、显微镜台、试剂瓶身等物体表面，喷涂完全湿润，不需擦拭，自然风干。
2. 培养箱内壁喷涂完全湿润后，等待10分钟，用无菌吸水纸吸干内壁上的残留液体。


操作
操作过程中人是最大的一个污染源，人类1个小时会脱落3*10⁴-4*10⁴个细胞；24小时会脱落10⁸个细胞，1年会脱落3.6kg的死细胞。从人身上掉落的颗粒达到10⁴/min（颗粒直径0.5μm）。

人	脚	100-1000 个微生物/cm2
	头皮	106个微生物/cm2
	额头	105个微生物/cm2
	喷嚏	104 – 105个微生物
	唾液	107个微生物/mL
无菌服	6小时后	1 – 6个微生物/cm2
空气	户外	100 – 500个微生物/m3
	户内	500 – 2000个微生物/m3

人类的皮肤总面积约2m²，生活约10¹²个微生物；我们1g的排遗物中约有10¹²个微生物。    

如何进行污染源排查？
可通过控制变量法对整个培养操作流程进行分析：培养试剂及辅助试剂等条件不变，重新复苏一株细胞，复苏时水浴要注意水浴不能没过冻存管瓶盖，传代时不能触碰吸管尖头部或容器瓶口。操作前需要用75%的酒精擦拭无菌操作台面。观察细胞是否有污染现象。


试剂
☆  空培不能用于污染来源排查
●  分别空培胰酶、PBS、冻存液、高压水。即便存在污染，但是由于营养（碳源、氮源、无机盐、生长因子）不完全，不一定会像实验中那样长出菌斑。
●  空培血清时，因为血清中富含蛋白，空培过程中会有沉淀产生，并且随着培养时间的延长，沉淀会逐渐增多，而这些沉淀往往会被误以为是污染。
●  空培完全培养液（血清+基础培养基）时，首先要会区分沉淀和污染。因此对经验要求高。其次，若完全培养基培养后有污染出现，也不好判断是血清还是基础培养基，或者是操作过程中带入的污染。

如何进行污染源排查？
血清：其他试剂保持不变，仅更换血清。
基础培养基：其他试剂保持不变，仅更换基础培养基。
PBS：其他试剂保持不变，仅更换PBS。
胰酶：若细胞复苏的很好，一传代就污染，可以尝试其他试剂保持不变，更换消化用胰酶，看细胞状态。
细胞反复复苏都会出现污染，那可保持培养体系不变，培养其他类型且适用于此培养体系的细胞，观察是否有污染出现。整个营养体系：基础培养基、血清、营养添加物都可使用控制变量法进行排查。

 

耗材
培养基及辅助试剂等条件不变，使用新耗材（培养皿或培养瓶、枪头）培养细胞，观察细胞是否有污染。


细胞本身
■  细胞本身携带污染源。可对细胞进行无菌检测（细菌、真菌、支原体）。
■  细胞分化，细胞一旦分化，很难逆转，无法通过外界营养体系和生长条件的调整“起死回生”。
■  细胞老化：细胞一旦老化，是无法逆转的。
因此，大家需要学会观察细胞的形态并进行分析，可以按照这几点进行控制变量排查，如若确认是细胞本身问题，若细胞本身不是很昂贵，建议丢掉重新培养，若较珍贵，污染后可尝试根据污染种类选择合适的抗生素进行杀灭，分化和老化是没有办法补救的。
 

好啦，今天的讲解就到这里啦，
细胞出现问题的老师也不要着急哦，
按照上述办法可以自行排查下污染源，
根据结果选择相应对策解决问题~
祝各位老师实验顺利哦


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